雞白血病診斷方法比較與研發新思路

劉會芳（石家莊市神九畜禽疾病防治及藥物研究所）

劉興林陳桂清（河北省泊頭市農業局）

雞白血病特別是J亞型白血病（俗稱血管瘤）在我國的快速傳播，給養雞業造成了極大的損害，對全國的雞育種體系建設也形成了巨大的威脅。客觀形勢的發展使得廣大種雞場對白血病的診斷特別是快速診斷工作提出了很高很迫切的要求。今結合種雞場的生產實際，就雞白血病的有關診斷方法進行評述，並對白血病快速診斷產品研發提出一些新的思路，以供參考，以求引玉。

1 現在的診斷方法

現在雞白血病的診斷方法主要有以下幾種：一是病毒分離法；二是組織病理診斷法，目前已有很好的單克隆抗體免疫組化染色法；三是血清學診斷，目前主要的是ELISA（酶聯免疫吸附試驗）法；四是PCR（聚合酶鏈式反應）法。

1.1 病毒分離鑑定法

分離各亞型白血病病毒是很基礎性的工作，也是確診的重要手段。對於研究病毒的各種特性、機理和研發相關疫苗與藥物等都具有很重要的意義。對於自國外引進種雞的國家來說，一旦暴發白血病，其病毒的分離工作，對於追查病毒的來源具有特別重要的意義。

分離白血病病毒大體需要以下幾個步驟：一是製備雞胚成纖維細胞（CEF），有時為了排除內源性病毒的干擾，需製備對內源性病毒有抵抗作用的細胞或細胞系；二是病料的處理和接種；三是病毒的檢測。

這種方法對診斷來說，結果最確切。不利之處，一是時間長，一般需要十幾天甚至更長的時間；二是需專業裝置、專業人員、專門試劑材料等；三是成本很高，成功率不太高。本方法單對診斷來說，並不是好的選擇。一般實驗室沒有這個能力，絕大多數種雞場也不具備應用能力。

1.2 組織病理診斷法

常用的方法是對HE（蘇木精—伊紅）染色切片進行顯微觀察。觀察特徵性的腫瘤細胞、腫瘤結節及細胞核與細胞漿變化。目前已大量使用的方法是，利用白血病病毒的特殊單克隆抗體使用細胞免疫組化染色法進行檢測，這種方法可以直接確定各種組織中的腫瘤細胞病變與何種白血病病毒的關係，是一種很確切的方法。還有進一步利用組織晶片與免疫組化染色相結合來檢測的方法。

還有一種方法就是間接熒光抗體法（IFA），就是用單抗或單因子血清和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠或抗雞Ig抗體做間接熒光試驗，在熒光顯微鏡下觀察有關呈病毒特異性熒光的細胞。這也是一種結果較確切的方法。

這些方法需要專門的實驗室、專門的裝置器材及專業的人員，帶有很強的科研性質，大多種雞場無法做這些工作，而且對種雞的（提前）淨化來說有嚴重的滯後性（腫瘤早已形成），在種雞場實際生產中利用價值不大。

1.3 血清學診斷

國外在上世紀60年代採用禽白血病補反檢測方法，該方法敏感但操作複雜。我國八十年代開始採用檢測羽髓的瓊脂擴散試驗（AGP），該方法適合大面積操作，在我國種雞淨化方面曾起到很大作用。利用白血病病毒有關基因重組產物作抗原也能很好地對白血病抗體進行檢測。

目前進行應用最廣泛的是ELISA（酶聯免疫吸附試驗）法。該方法既可做白血病各亞型的抗體檢測，也可做病原檢測。其使用大體過程包括樣本準備、洗滌液準備、具體操作、結果判定（陽性陰性）等。ELISA商品化的產品多為白血病A、B、J亞型的抗體檢測和群特異型的P27抗原檢測。目前的科研發展已完全可以做出白血病各亞型的抗原檢測的產品。

ELISA檢測仍有一些未解的問題，如抗體檢測中的雛雞早期陽性率過高問題，有人認為是產品的適用性問題，也有的認為是內源性病毒部分表達所引起的干擾，目前尚有爭論。另外就是檢測抗原時所出現的內源性病毒的干擾問題，一是對產蛋種雞可以用含內源性病毒較少的蛋清來檢測，二是將來可以選用特殊的對白血病內源性病毒不發生反應的白血病病毒單克隆抗體來做產品檢測原料，從而在檢測中避開內源性病毒的干擾。

在種雞場的實際生產中，一少部分大型種雞場已開始進行白血病的ELISA檢測，大多數種雞企業未進行此項工作。所以上游的原種雞場、祖代雞場不進行相應的檢測，一旦發生白血病，疾病就會沿育種體系鏈逐級放大、肆意流行，許多下游的父母代種雞場和商品代養殖場損失就會甚為慘重。相關資料顯示，如果不進行白血病檢測和陽性種雞淘汰工作，一個祖代場的白血病感染率是0.5%左右，其下游父母代種雞場則為5﹪以上，再下游的商品代養殖場就會達到10%~40%。

造成我國育種體系中大多數上游種雞場對白血病不加檢測原因，一是相關試劑目前幾乎全部來自國外，價格昂貴，一些種雞場承擔不起；二是此方法需專門場所、專門裝置和專門的人員，需要不少的投入，檢測時間也需幾個小時，做大面積的檢測所投入的人力成本也很高；三是一些企業本身對此病的檢測重視不足。解決這些問題，一要支援和加快相關產品的國產化；二是國內研發者要適應產品的商品化要求和商業化模式，在科研產品的商品化和商業化操作問題上要特別注意產品的靈敏度、穩定性、有效期與持續性技術服務等問題；三是種雞企業也要加強對相關疾病檢測的重視。

當然，對於種禽白血病感染過多（如超過40%）的種禽場，也可以借鑑國外的經驗，提取本場白血病病毒做滅活苗進行防疫，同時嚴格進行病毒檢測，將帶毒種禽嚴格淘汰。這樣做的不利之處，是其檢測的代次要多一些。

1.4 PCR（聚合酶鏈式反應）法

PCR法是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。在白血病各亞型病毒的特定基因（gp37、gp85、P27、P12等）和全部基因的分析等方面具有基礎性意義。對研究病毒的演化、進化和病毒的診斷具有重大意義。其基本過程是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個週期,迴圈進行,使目的DNA得以迅速擴增，然後進行電泳檢測。利用PCR的檢測方式有多種，如熒光PCR、RT—PCR等。

PCR靈敏度高，能夠檢測到來自腫瘤組織、病毒感染的其他組織和細胞培養物中微量的白血病前病毒DNA，通過反轉錄PCR(RT—PCR)還可以檢測白血病病毒RNA。對於內源性病毒的干擾，可以選取特定的基因片段（如pol）做引物來避免。

目前PCR法是相關科研單位常用方法，個別種雞場也開始使用這種方法。由於這些方法需要專門的試驗室、專業裝置和專業人員，成本較高且無法做現場檢測。這種方法也不適合種雞場的大面積使用，一般種雞場也沒有能力做這些工作。

1.5小結

對一般種雞場來說，沒有能力去做病毒分離和組織病理診斷，PCR法因要求較高也不易開展，只有ELISA方法在很小範圍得到應用。還有一個原因就是相關裝置和試劑價格高，企業承擔不起也不願接受，如ELISA法檢測一隻種雞的一項指標，市場要價在40元左右，如果一個種雞場養5萬套種雞，做全面檢測就需要至少200萬元，顯然種雞場無法接受，也承擔不起。目前種雞場對檢測產品的要求有以下幾點：一是產品靈敏度高、穩定性好；二是價格低廉，一頭份費用在幾元以內；三是檢測快速，最好在幾分鐘內完成；四是能現場操作，且操作步驟簡單。

實際上，有一類科研產品能夠滿足這些要求。那就是白血病膠體金快速診斷產品。這類產品在將來有可能成為一種應用廣泛的檢測手段。

2 白血病膠體金快速診斷試紙

膠體金試紙是利用抗體、抗原膠體金標記技術和免疫層析技術進行抗原或抗體結合形成夾心免疫複合物並顯色的技術。此類產品在禽流感、新城疫、法氏囊等疾病的診斷上已有很好的應用。由於金標技術是很成熟的技術，而白血病病毒的單克隆抗體和重組基因產物也有了很好的產品，所以白血病膠體金快速診斷試紙研發已具備很好的前提。因試紙產品具有靈敏度高、穩定性好、操作簡便可現場操作、診斷快速、價格低廉且不需其他專業裝置等特點，更容易為種雞場大面積使用。所以大有研發的必要。今就有關思路進行簡介，以供感興趣的科研工作者參考。

2.1白血病試紙研發的具體思路

目前製作多種亞型病毒的檢測試紙和通用試紙的條件都已具備，但據目前白血病流行特點來說，以下試紙應在研發上應優先考慮：

試紙一：普通型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

檢測線選用P27衣殼蛋白的一株單抗， P27衣殼蛋白的另外一株單抗或多抗與膠體金相結合（標記），質控線則選相應的二抗。這樣的試紙可以檢測所有的白血病病毒。

試紙二：J亞型白血病抗原膠體金快速診斷試紙

檢測線選用J亞型病毒gp85表面蛋白的一株單抗，另外一株J亞型病毒gp85表面蛋白的單抗或多抗與膠體金結合，質控線則選相應的二抗。這樣的試紙可以檢測樣本中是否有J亞型白血病病毒或檢測到的白血病病毒是否是J亞型的。

試紙三：普通型的白血病抗體膠體金快速診斷試紙

檢測線選用基因重組表達的P27衣殼蛋白，另一基因重組表達的P27衣殼蛋白與膠體金相結合，質控線則選擇相應的抗體或單抗，亦可實驗選用SPA。

這三個試紙恰當選用，既可檢測白血病病毒，又可檢測白血病抗體，還可以確定白血病病毒是否為J亞型的。基本能夠滿足種雞場的檢測要求。

2.2關於白血病膠體金試紙的檢測質量提高的相關技術問題

目前常有的膠體金是中等顆粒的「紅金」。以此為基礎的產品，在檢測過程中常出現「紅霧」，從而影響檢測線的結果觀測。在研發出「紅金」試紙後，如果有關科研人員想進一步提高試紙的檢測質量，可以考慮應用目前國外個別公司開始使用的大顆粒「紫金」技術。以「紫金」為基礎的試紙在檢測過程中不出現「紅霧」，從而能夠大大提高觀測的質量。

只是在研發過程中要注意以下兩點：一是以「紅金」為基礎的資料到「紫金」處，不一定適用，要做一部分修改；二是「紅金」下的穩定性與「紫金」下的穩定性不同，這裡的穩定性有兩個方面要考慮，一是抗體或抗原與膠體金的結合，另一個是產品的有效期的問題。