微生態製劑對雞腸道微生物區系影響研究進展
雞的腸道棲居著大量的微生物，構成了微生物區系（微生物組），主要是由細菌（厚壁菌門和擬桿菌）構成。腸道微生物區系對雞的生長和健康非常重要，這些微生物區系的變化受到各種因素的影響,包括宿主本身（年齡、品種）、飼養管理、日糧水平和飼料新增劑等。過去人們就這些因素對腸道微生物區系的變化研究很多，但是研究的方法是傳統的培養方法，而雞消化道中90%的細菌用傳統的培養方法不能鑑定出［1］，這樣就大大限制了腸道微生物組成的研究。直到21世紀初16S rRNA目標基因分析技術在微生物研究上的應用，使人們更進一步瞭解複雜的腸道微生物以及它的數量、種類和結構。目前關於腸道微生物區系的多樣性及具體的系統發育及功能機制仍然不是十分清楚，因此本文將近幾年微生態製劑新增後對雞腸道微生物區系影響的研究進展作一綜述，以便後續的研究。
1 雞腸道的正常菌群
宿主體內的正常菌群參與與宿主相關的生長髮育、營養物質的消化吸收、合成菌體蛋白、免疫調控及生物拮抗等過程。對於雞而言，外界環境、年齡、飼料原料和營養水平對整個菌群的變化很大，但是在正常情況下，宿主與菌群保持動態的微生態平衡。當有害菌佔優勢從而導致有益菌數量大大減少，這樣會破壞正常菌群從而引發疾病。研究雞腸道正常微生物菌群的種類、結構及變化過程為目前正在研究的微生態製劑提供理論基礎。
1.1 胚胎期的正常菌群
以前人們一直認為胚胎期的健康雞是處於完全無菌的空間中，但是Kizerwetter-S′wida等［2］最近研究得出在胚胎後期定居著一些革蘭氏陽性菌，其中腸球菌屬是優勢菌，其它一些屬包括葡萄球菌、大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷伯菌、腸桿菌。
1.2 消化道前段的正常菌群及數量變化
雞出殼後消化道微生物定植非常迅速［3］，一些腸桿菌屬、腸球菌和梭菌在消化道定植。He等［4］研究得出雞出殼後1h腸球菌和梭菌在嗉囊和腺胃中可以檢測到，3日齡嗉囊和腺胃中含有鏈球菌、大腸桿菌和乳酸菌［5］，5日齡雞嗉囊中乳酸桿菌變為優勢菌。雞開食2d後十二指腸中乳桿菌開始出現並迅速增殖，十二指腸中微生物種類較少，其優勢菌主要是乳桿菌和腸球菌。當雞開始採食飼料到2周時乳酸桿菌在小腸定植隨後發展成為優勢菌群［1，6］。
Guan等［6］研究了乳酸桿菌在雞消化道中大致的數量變化，在出生後1~7d，每克消化物中含乳酸桿菌的數量為106~109cfu，而出生8~42d後每克消化物所含乳酸桿菌的數量範圍變為108~108.5cfu。空腸佔優勢的菌群為雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌及真桿菌。迴腸的不同部位菌群差異較大，前端靠近空腸，菌群數量較少，而回腸末端緊接盲腸，所以菌群數量較多，且厭氧菌佔大多數（>95%）。Lu等［7］得出雞迴腸裡大約70%的微生物是乳桿菌屬，其次是梭菌屬（11%）、鏈球菌屬（6.5%）及腸球菌屬（6.5%）；且迴腸分別在7~12和21~28日齡菌群結構穩定，但在整個3~49日齡期間菌群結構有顯著變化。
1.3 消化道後段的正常菌群及數量變化
消化道後段菌群數量多而且複雜，優勢菌群是專性厭氧菌，總量達1011個/g，盲腸要到13日齡才開始出現雙歧桿菌、擬桿菌、真細菌並逐漸增加。到25日齡時盲腸內菌群才完全建立。雛雞在30日齡時，其消化道菌群才與成年雞一致。消化道後端的最優菌群是擬桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化鏈球菌，其次是乳桿菌、鏈球菌和腸桿菌等。盲腸和直腸是食物滯留的主要部位，也是細菌總量最大的部位。
2 益生菌對腸道微生物區系的影響
益生菌種類很多，主要包括乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌、片球杆菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、乳球菌、大量的酵母菌及混合培養物等。關於益生菌對雞腸道微生物區系的變化及腸道的健康的研究很多，它能夠改善宿主腸道的健康［8~10］。研究證明不同的益生菌只是針對不同的病原微生物發揮作用［8，11，12］。本文分別介紹幾種主要的益生菌新增後的效果及研究情況。
2.1 枯草芽孢桿菌
枯草芽孢桿菌和炭疽桿菌都屬於芽孢桿菌屬，芽孢桿菌作為益生菌在研究上佔有很重要的位置［13］，主要表現在三個方面：一是能夠產生孢子，細菌孢子能高度抵抗大量的物理應激因子，包括熱、紫外線輻射、化學和真空壓力；二是可以產
生較強的蛋白酶、脂肪酶和澱粉酶，能夠有效降解複雜的碳水化合物；三是芽孢桿菌類的產品的保質期、貯藏和運輸條件都不復雜［14］。這些特徵使得芽孢桿菌在工業生產中很受青睞。
2.1.1 枯草芽孢桿菌能有效改變腸道乳酸桿菌和大腸桿菌的數量
關於枯草芽孢桿菌能顯著減少各個腸段大腸桿菌的數量許多學者的研究結果一致，而對乳酸桿菌的數量變化結果不一，Molnár等［15］研究了新增不同濃度（7.27×108~7.27×1011cfu/g）的枯草芽孢桿菌（CHCC3810~DSM17299）對肉仔雞腸道微生物的影響，得出與對照組相比在盲腸中沒有差異，但是在迴腸中乳酸桿菌顯著減少（P<0.05）；而Li等得出新增1×108cfu/g枯草芽孢桿菌後空腸和盲腸乳酸桿菌顯著增加（P<0.05），空腸和盲腸內容物中乳酸桿菌的數量分別提高了38.15%（P<0.05）和22.91%（P<0.05）；Zhang等［16］得出新增108cfu/g枯草芽孢桿菌UBT-MO2株後迴腸和盲腸乳酸菌有增加的趨勢但是變化不顯著。以上這些研究結果的不同可能是枯草芽孢桿菌的不同菌株對乳酸桿菌的數量變化差異較大，再者枯草芽孢桿菌可能和乳酸菌之間存在某種具體的調控機制，有待進一步研究。
2.1.2 枯草芽孢桿菌能有效抑制腸道產氣莢膜梭菌
La等［17］試驗得出新增枯草芽孢桿菌後能有效的抑制雞胃腸道遠端產氣莢膜梭菌的定植，使其數量減少；Sathishkumar等［18］得出枯草芽孢桿菌PB6株（ATCC~PTA6737)顯著降低產氣莢膜梭菌導致的壞死性腸炎，並且使產氣莢膜梭菌的數量顯著降低（P<0.05）。
2.2 丁酸梭菌
丁酸梭菌是一種產丁酸、產孢子的厭氧革蘭氏陽性菌，在土壤和動物小腸中都存在［19］。Yang等［20］研究得出丁酸梭菌對肉仔雞腸道微生物有影響，2×107和3×107cfu/kg丁酸梭菌顯著降低了肉仔雞14和42日齡盲腸中大腸桿菌的數量，顯著降低肉仔雞14和42日齡盲腸中沙門菌和產氣莢膜梭菌的數量，但是顯著增加21和42日齡盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量（P<0.05）。Zhang等［21］證明了飼料中新增1×109cfu/kg的丁酸梭菌只增加了40日齡雞盲腸乳酸桿菌的數量，其它有益菌沒有顯著變化；Zhao等［22］研究得出日糧中新增1×109cfu/kg丁酸梭菌顯著減少肉仔雞21日齡時盲腸擬桿菌的數量，Angelakis等［23］研究得出二次接種4×1010cfu/kg的乳酸桿菌也顯著降低了雞糞便中擬桿菌的數量。Yang等［20，21］也得出新增丁酸桿菌後顯著增加盲腸乙酸、丁酸、戊酸及短鏈脂肪酸的濃度，降低了盲腸的pH值。結果表明新增丁酸梭菌對盲腸微生物區繫有利。
2.3 乳酸菌和屎腸球菌
乳酸桿菌對肉雞腸道微生物的研究很多［24~25］。乳酸菌能產生大量的有機酸，降低腸道內的pH值，抑制致病性微生物的增殖。也有研究得出乳酸桿菌的新增能夠有效抑制傳染性梭菌群和彎曲桿菌的數量［26~27］。Fooet等［28］和Thanh等［29］研究得出乳酸菌的代謝產物包括有機酸、抑菌素和酒精，這些物質能夠控制或抑制腸道病原菌的生長，並且Loh等［30］得出其代謝產物更容易處理和儲存，並且不會對腸道其它常駐有益菌產生抵抗性。
屎腸球菌是一種在腸道中正常定居的乳酸菌，能夠產生乳酸和細菌素。關於屎腸球菌對動物腸道微生物的研究很多，最先是在奶牛上研究，並且有研究得出新增屎腸球菌能減少狗腸道中產氣莢膜梭菌的數量、增加雙歧桿菌和乳酸桿菌的水平［31，32］。Levkutet等［33，34］研究得出當肉雞感染沙門菌後新增屎腸球菌EF55能顯著減少盲腸中沙門菌的數量；Ghareeb等［35］研究得出新增屎腸球菌能降低雞空腸中彎曲桿菌的數量；Samli等［36］發現在肉仔雞開食料中新增屎腸球菌NCIMB10415能增加回腸中乳酸桿菌的定植。Cao等［37］最新研究得出21和28日齡的科寶公雞與陰性對照組相比，感染大腸桿菌的陽性對照組空腸絨毛高度顯著減少（P<0.05）、隱窩深度顯著增加（P<0.05），但是新增109cfu/kg的屎腸球菌的試驗組與其它兩組相比絨毛高度顯著提高（P<0.05）、隱窩深度顯著降低（P<0.05），這與Samli等［36］和Chichlowski等［38］的研究結果一致。絨毛高度和隱窩深度是衡量動物腸道結構和營養吸收功能的兩個重要指標，這說明屎腸球菌有利於改善腸道的結構、增加腸道的吸收功能，其作用機制主要是屎腸球菌通過改變pH值和空間位阻使得大腸桿菌在腸黏膜上的黏附性降低，從而避免大腸桿菌對絨毛和隱窩的損壞［24］；對於腸道微生物而言，與陰性對照組相比，新增屎腸球菌後14和28d時能顯著減少大腸桿菌數量（P<0.05），而新增抗生素組在21和28d時顯著減少大腸桿菌數量（P<0.05），這說明屎腸球菌發揮效用的時間比抗生素髮生效用的時間要早；新增屎腸球菌後28d能顯著減少產氣莢膜梭菌的數量（P<0.05），之前的10~21d沒有顯著差異（P>0.05），這與Vahjen等［32］的研究結果相一致；與陰性對照組相比，新增屎腸球菌後21d能顯著增加乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量（P>0.05）。
2.4 益生菌的新增對蛋雞微生物區系的影響
以前關於益生菌對微生物區系的研究主要針對肉仔雞，在蛋雞上研究較少，近幾年在蛋雞上也進行了大量的研究。Choe等［39］研究了植物乳桿菌（COM456）對羅曼布朗母雞糞便pH值及糞便乳酸桿菌和腸桿菌的數量影響，結果表明新增比例不同，糞便pH值顯著減少的時間也不同，乳酸桿菌新增比例從0.6%~1.2%，糞便pH顯著減少的時間是從23周齡開始，到29周齡結束；新增0.9%和1.2%的植物乳桿菌COM456，糞便中乳酸菌數量顯著增加開始於15周齡。從這些結果可以看出乳酸菌得達到一定的比例才能對微生物區系產生影響，而且不同的比例微生物區系顯著變化的時間也不同。
2.5 益生菌主要的作用模式
益生菌的作用模式很多，其中主要通過兩個基本的機制來改善腸道微生物平衡和內源微生物區系，一個是競爭性排除，一方面通過競爭營養物質來產生抑制病原體的抗微生物代謝產物，另一方面通過競爭黏附位點從而使病原體無法定植，一般情況下有害微生物在腸道細胞壁的附著是其致病的前提，而益生菌在數量上的增加無疑會減少有害微生物的附著位點。Higgins等［40］和Stern等［27］研究得出益生菌能夠減少沙門菌在腸道的定植率，分別減少60%和44%；Decroos等［26］和Stern等［27］研究得出乳酸桿菌的新增能夠有效抑制傳染性梭菌群和彎曲桿菌的數量。益生菌的菌種、菌株、提取源不同也會影響腸道特定病原菌的抑制效果。Watkins等［41］和Jin等［11］研究得出新增乳酸菌後會抑制盲腸大腸桿菌的數量，但對於其他細菌沒有抑制效果，而Murry等［42］得出新增乳酸桿菌後只顯著抑制了產氣莢膜梭菌的數量而對其他細菌沒有顯著影響。另一個是免疫調節，通過先天性免疫或獲得性免疫起作用，益生菌通過腸道黏膜免疫系統來對腸道微生物發揮免疫作用，而且不同的益生菌菌種、菌株其免疫調節效果也不同，Koenen等［43］就證明了不同菌株的益生菌其免疫效果的不同。
3 益生元對腸道微生物區系的影響
Gibson［44］最先對益生元給了一個定義：「不消化的食物成分，並且這些成分可通過選擇刺激一個或幾個腸道生理性細菌的增殖和/或活性，對宿主產生有益的健康效應」。Gilbson［45］後來又對益生元做了進一步的定義：一種選擇性發酵的飼料原料導致胃腸道細菌的組成和/或者活性特異性變化，從而對宿主健康有益。大多數的益生元是由碳水化合物鏈所構成的可溶性纖維，相對於益生菌而言它更具有優勢，因為它價格低廉、低風險、更容易處理。益生元是由一種或幾種單糖（果糖、木糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖）組成的低聚糖或者菊粉。功能低聚糖屬於非營養性飼料原料，因為它含有β-1，4糖苷鍵，而且這些糖不能被腸道消化酶所水解從而可以到達後腸道被後腸道微生物所消化［45］。
3.1 低聚果糖（FOS）和菊芋
低聚果糖是以蔗糖為原料，利用果糖基轉移酶的作用，在蔗糖（G~F）分子的果糖基上通過β-2，1糖苷鍵結合1~3個果糖（F）而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）及其混合物。它們主要存在於大麥、小麥、黑麥、馬鈴薯、萵苣、香蕉、洋蔥等植物及酵母中。新增不同FOS對腸道微生物區系的變化效果也不一樣，甚至當超過一定濃度，反而會使有益菌的數量下降。
Choi等［46］和Kim等［47］得出新增0.22%~0.25%FOS會顯著提高雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量，顯著降低產氣莢膜梭菌和大腸桿菌的數量，這說明腸道不同菌種對低聚果糖的利用情況不同，乳酸桿菌和雙歧桿菌能很好地利用低聚果糖，而沙門菌、大腸桿菌、產氣莢膜梭菌等有害菌不能利用低聚果糖；當FOS新增量達到0.5%時，與對照組相比差異不顯著且有益菌有降低的趨勢。
Ten等［48］研究顯示，新增過量的FOS會使腸道微生物的發酵速率增加過快，從而損傷腸道黏膜屏障，增加腸道的滲透性使其更容易感染有害菌。菊芋又叫洋姜，其地下塊莖含有菊糖、低聚果糖（佔12%~15%）而被包括在益生元中，它是由果糖經β-2，1鍵連線而成的線性直鏈多糖，末端常帶有一個葡萄糖，聚合度（DP）通常在2~60之間。
Hold等［49］研究表明洋姜顯著增加了雙歧桿菌、乳酸桿菌和丁酸梭菌的數量。Sritiawthai等［50］研究日糧中新增洋姜作為益生元對24周齡產蛋母雞腸道微生物的影響，新增100mg/kg洋姜顯著增加盲腸乳酸菌群的數量，從而使雞蛋中蛋白的含量、蛋白蛋黃比率及蛋白高度顯著增加。也有研究表明新增1g/kg菊粉後，產蛋後期（64~75周齡）母雞小腸絨毛高度和隱窩深度都顯著增加（P<0.05），增加了營養物質的吸收區域；迴腸和盲腸中乳酸桿菌、雙歧桿菌顯著增加，大腸桿菌數量顯著減少，沙門菌的數目變化不大。
3.2 甘露寡糖（MOS）
從酵母細胞壁中提取的甘露寡糖（MOS）之所以成為益生元中研究的熱點主要是因為它包含葡聚糖、甘露糖和蛋白組分，其中甘露糖在前消化道會發生部分水解。Spring等［51］發現在日糧中新增4000mg/kgMOS能減少盲腸中鼠傷寒沙門菌的數量；Iji等［52］得出MOS能夠減緩沙門菌導致的盲腸黏膜發炎，並且增加腸道絨毛的高度；Fernandez等［53］進一步得出MOS能夠減少盲腸中沙門菌的數量，因此MOS得到很大的關注。Kim等［47］研究證實新增0.025%MOS可顯著增加小腸乳酸菌的數量和顯著減少大腸桿菌的數量，而總細菌數量和產氣莢膜梭菌數無顯著變化，當新增量達到0.05%時，這4種細菌都出現顯著變化，因此0.05%MOS在改變腸道微生物區繫上的效果優於0.025%MOS。由於酵母細胞壁中含有MOS和β-葡聚糖等益生元物質，所以Revathi等［54］研究了完整的酵母菌細胞壁產品（CitriStim）對雞腸道微生物區系的影響，得出新增0.2%酵母菌細胞壁產品使得雞42日齡時盲腸的大腸桿菌數降低了31%，沙門菌降低了20%。Bovera等［55］經分析認為MOS使得大腸桿菌和沙門菌進行了凝聚，從而抑制這些病原菌粘附於腸黏膜。
3.3 纖維寡糖（COS）
纖維寡糖（COS）是一類從植物纖維素中經過化學或者酶水解得到的由2~7個吡喃型葡萄糖單元通過β-1，4糖苷鍵連線在一起的寡糖，是一種新型的功能性寡糖。植物纖維素容易獲取，如從稻草、甜菜渣、紫花苜蓿等，並且它是一種價格低廉、可再生、自然界豐富的飼料資源，利用其生產COS可以提高其利用價值，具有較高的環境效益和經濟效益。Song等［56］通過在肉仔雞日糧中新增1.5g/kgCOS顯著提高空腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度的比率（P<0.05）。Leeson等［57］認為COS能夠水解成短鏈脂肪酸（SCFA），如丁酸，而丁酸作為腸黏膜的能量來源，能夠刺激腸絨毛的生長增加絨毛高度；新增COS後顯著增加乳酸桿菌數、而顯著降低了大腸桿菌數，但是對雙歧桿菌和沙門菌沒有顯著影響；新增COS後黏膜免疫屏障滲透性顯著降低（P<0.05），這表明降低了病原微生物的侵入。Cheled-Shoval等［58］認為低聚糖能夠模擬病原菌在腸道黏膜上的結合位點，如有些病原菌粘附在1型菌毛上，因此新增低聚糖後低聚糖直接可以與病原微生物接觸，從而避免病原菌與腸道黏膜接觸降低腸道內病原菌的定植。另一方面COS能夠為益生菌與病原菌競爭提供有利的環境，Rodríguez-Cabezas等［59］和Hasunuma等［60］發現COS能夠抵抗營養物質在小腸的消化從而使一些營養物質可以到達後腸為益生菌提供原料和營養，從而更有利於與病原菌競爭或者產生更多的酸性物質抑制病原菌的生長。
3.4 益生元的作用模式
從大量的有關益生元的研究文章得出益生元主要表現在以下幾個方面的功能：一是選擇性刺激有益菌在消化道後端的生長等［61，62］，動物自身分解的酶只能降解α-1，4糖苷鍵，而益生元分子間以β-1，2糖苷鍵或者β-1，4糖苷鍵相連，這樣能以未降解的形式進入到消化道後端，然後腸道微生物就會利用其作為營養物質，併產生CO2和揮發性脂肪酸。二是抑制病原菌（大腸桿菌K99、鏈球菌、嗜血桿菌等）在腸道黏膜的附著等［63］。研究表明腸道病原菌必須首先與腸黏膜結合才能在胃腸道定植和繁殖而致病。這種結合是通過細菌表面外源凝集素與上皮細胞特異性的糖分子相結合,現已證實大多數腸道病原菌具有與甘露寡糖特異結合的外源凝集素；三是可以通過直接影響細胞受體或者腸道微生物的變化等改善腸道免疫功能［64］。寡聚糖也具有抗原特異性，能夠產生特異性的免疫應答。
4 小結
益生菌和益生元及其它們的混合物（合生元）在維持腸道微生物區系平衡、保持腸道健康上發揮著很大的作用，但是它們具體的作用機制還沒有完全研究清楚，因此在商業生產上得儘量保證其功效發揮到最大，應該從以下兩個方面考慮：首先，新增的時間很重要，菌株需要一段時間來適應腸道環境，並富集到一定的數量才能產生功效，所以應該儘早地新增。其次，劑量也影響使用效果，家禽消化道中的消化液不利於某些有益菌的存活，因此需要足夠的劑量來補償腸道消化液造成的損失；但是不同的益生菌和益生元對消化道消化液的抵禦能力不同，因此，針對不同的菌種，應用的劑量各不相同；對於不同病理狀況下的家禽的有效劑量也不一樣。